Nat Genet：颠覆认知！科学家揭示CRISPR/Cas9凹槽全新连接机制，未来有望实现精准连接

近来，赞州大学伯克利分校的Jacob Corn的团队在Cas9挤压后的复原程序上取得了颠覆认知的重大突破。通讯总的来真为是，Corn的团队这次消除了一个长年拖累生物学家的难题：用CRISPR-Cas9割断细胞膜的DNA之后，细胞膜根本是如何可选择用哪种方法补救碎裂的缺口的？更重要的是，他们的这个注意到甚至可以让生物学家以后根据自己的需求，操作者细胞膜的复原方法，让细胞膜性状组DNA在被Cas9割断后，按照需求去复原缺口。正真为借助灵巧挤压，灵巧补救。这对很多需要看看性状复原的遗传传染病而言，毕竟是个好消息。上周四，Corn的团队的这一重要研究工作成果所发表在《自然遗传学》上。CRISPR-Cas9只是圣灵的手术刀，复原还是得靠细胞膜多年来以来，我们都形象地把CRISPR-Cas9叫看看“圣灵的手术刀”，而不把它叫看看“圣灵的针线包”，主要是因为Cas9只负责灵巧的割断DNA，复原的任务要交给细胞膜自身。通经常完全，CRISPR-Cas9割断DNA演化成的双链碎裂后，细胞膜会很快触发即时复原程序。其里面极为重要的两条是：非相似性外侧联接和相似性重组。其里面非相似性外侧联接复原程序被生物学家用的最多，成本也最高。它就是不管二十一，早日把碎裂的DNA联接出去，维持DNA的安定。这种复原方法绝大部分完全会在挤压位点产生随机填入或其会，直接导致性状功能丧失。无论如何，对细胞膜而言，损失一个性状，比挂了赞同好多了。这种复原方法回事也是细胞膜的最经常见复原方法。鉴于这种复原方法的特征，它被广泛用于性状功能的研究工作。而相似性重组复原程序，则是在有相似性酪氨酸DNA氨基酸的定位下，用一段合理的性状氨基酸替换原本错误的性状氨基酸。也就是我们经常真为是的：哪里坏了，换哪里。生物学家和医生治疗性状变异导致的传染病，依赖的就是这种复原方法。目前，相似性重组复原过程里面运用于的特罗斯季亚涅齐DNA旧版本有两种：一种是双链DNA，另一种是单链DNA旧版本复原（SSTR）。CRISPR/Cas9割断DNA之后的可能复原程序不过，大量的研究工作声称，把双链DNA作为旧版本复原碎裂的DNA在绝大多数细胞膜多种类型里面总括经常偏高效的。相较而言呢，以单链DNA为复原旧版本的SSTR方式在人类细胞膜里面倒是很高效，所以运用于的也来得多。虽然SSTR成本高，但是Corn的团队在并不相同的人类抗体膜系里面看看研究工作还是注意到，SSTR的复原成本还是有不小的区别，从完全单方的0%，到非经常高效的30%。这其实暗示，SSTR是否是能已完成复原与细胞膜多种类型有一定的共同点。再仔细观察一想呢，并不相同细胞膜多种类型的性状表达高水平实际上是相差不小的，是不是某些特殊的DNA复原自营的打开或关闭，严重影响了SSTR复原的成本呢？并不相同旧版本的复原过程如果我们能注意到严重影响SSTR复原程序的关的性状，那么在以后的临床应用里面，在研究工作部门赶紧去阿德关的的资讯。很幸运，SSTR在人体内里面复原的程序还鲜为人知。如果能消除这个拖累着很多生物学家的难题，那么Corn的团队赞同很最爱。此处应该想起斯托帕德那句话：“再一次一无所知，从头开始……这让我很最爱。”才智的实验设计Corn的团队的研究工作部门根本有多最爱我是没有人办法告诉了。不过，当我看到他们消除难题的思路时，我何止是很最爱，真为是是很兴奋，以至于饮用了5世青浓茶也没有人驱散的周二睡意，瞬间减弱。他们首先看看了一个理论上：既然是DNA碎裂的复原显现出了不安定的难题，那难题应该就处在细胞膜内跟DNA复原有关的性状上；如果在调控那些复原性状表达的同时，同步开展CRISPR-Cas9的挤出，和割断后的SSTR复原，不就可以通过二者反之亦然的相互作用认出严重影响SSTR的这两项性状了吗！于是，研究工作部门首先认出了2000多个跟DNA复原有关的性状。然后看看了一个非经常聪敏的设计。他们创造性的运用于了CRISPRi性状无论如何新科技、CRISPR-Cas9性状首先，他们给所有的细胞膜赞了个粉红色所发光性状，让这些细胞膜所发蓝光。所有的细胞膜都蓝莹莹的，真为好看~然后，给这些细胞膜分别装入用来无论如何复原关的性状的CRISPRi性状无论如何该系统。每个细胞膜无论如何扔掉一个复原关的性状，在一个有数百万个细胞膜的群体里面，就产生了2000个性状分别被无论如何扔掉的细胞膜库。建库过程紧接着，研究工作部门就要对那个粉红色所发光抗原性状下手了。他们把靶向挤压粉红色所发光抗原性状的CRISPR-Cas9卸下里会再次所发生什么，你们赞同能看看把，还需要我真为是吗~就让了，我还是真为是下吧。完美现况下（我们只真为是完美现况下），上面的细胞膜库紫色会再次所发生如下再次所发生变化。有些还是粉红色，理论上性状研究工作部门用流式细胞膜星象按照紫色，给所有的细胞膜分分成三拨：有6.8%的细胞膜还保持这粉红色，有67.5%的细胞膜不祚色了，22.8%的细胞膜变成了浅绿色。赞出去是97.1%，还有2.9%的细胞膜怎么了？这些细胞膜显现出了完美现况之外的情况，我们就不管它们了。未被重视的“公共交通闪灯”有了上面的细胞膜。卸下来的事情就好办了，用二代测序新科技，分析分析这三个细胞膜群体里面gRNA的高水平再次所发生变化，就可以告诉哪些性状会严重影响SSTR的成本了。这一分析不要紧，研究工作部门注意到之前认为与SSTR复原有关的DNA复原性状，其实与SSTR关连并不大。让研究工作部门意外的是，那些处在杜科尼贫血（Fanconi anemia；FA）的自营上的性状，与SSTR关连密切。杜科尼贫血是瑞士儿科医生Guido Fanconi在1927年首次路透社的，它是一种有名的经常染色体隐性遗传性IBD%E8%AF%8A%E6%B2%BB%E8%BF%87%E7%A8%8B%E4%B8%AD%E7%9A%84%E8%AF%84%E4%BC%B0-Part%202">血液该系统传染病。1992年路透社了4个可能与FA关的的性状，到今天已经鉴别出了20多个与FA的所发病有关的性状变异。FA自营涉及超多抗原多年来以来，研究工作部门认为，FA自营上的性状编码的抗原与识别和复原性状组里面的链间交联（ICL）有关。并不认为它与CRISPR-Cas9导致的DNA双链碎裂复原有关。这个注意到，被研究工作部门视为至宝。为了有利于证实FADNA复原自营上的抗原与SSTR复原方式成本反之亦然的关连。研究工作部门用CRISPRi分别安定地敲偏高了FA路径里面的FANCA，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCL，HELQ，UBE2T，USP1和WDR48。注意到SSTR复原方式成本祚着减少。如果在敲偏高的同时，用cDNA在细胞膜内安定地表达那个敲偏高的抗原，让它们的表达趋于安定到野生的高水平。研究工作部门注意到，SSTR复原方式成本提升8倍，回升到正经常高水平。这些研究工作声称，FA自营里面的许多性状对SSTR复原方式是必须的。更有意思的是，研究工作部门还注意到FA自营只严重影响SSTR，它不会促进非相似性外侧联接。基本上来真为是，在DNA被割断之后，细胞膜复原DNA的首选方法总括相似性外侧联接，这也是为什么这种复原方法多年来比例最高。FA自营就是个公共交通闪灯而FA自营更像个“公共交通闪灯”：在FA自营不活跃的时候，所有的卡车都朝一个侧向（非相似性外侧联接）开；但如果FA自营很活跃，那么它就要司令其里面一部分卡车往另一个侧向（SSTR）走。原来是这样！用论文第一后记“治疗镰状细胞膜贫血，成功的机会与用合理的性状替代突变的性状成本密不可分，”Richardson这么评价自己的研究工作，“如果你从高血压那里给予了100万个细胞膜，30%-40%的替换率赞同比10%的好多了。”今天看来，Richardson的愿望真为的有可能借助了。无论如何，生物学家可以通过分析细胞膜性状的表达高水平，月份预知一类细胞膜是否是较难SSTR。如果这类细胞膜SSTR成本偏高，甚至可以考虑临时激活FA自营。无论如何，生物学家受制于了Cas9挤压后的这层复原程序，未来给高血压换个性状啥的，那真为是是成本高多了。完整出处：Richardson C D, Kazane K R, Feng S J, et al. CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway[J]. Nature Genetics, 2018: 1.